Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов

Обновлено: 20.09.2024

Большинство белков относятся к высокомолекулярным соединениям, которые хорошо растворяются в воде. Растворение белков в воде связано с гидратацией его молекул и образованием вокруг частиц белка гидратной оболочки. Любые физические и химические факторы, нарушающие гидратацию молекул белка и нейтрализующие их заряд, приводят к понижению растворимости белка и способствуют выпадению его в осадок.

1. Осаждение белков при нагревании.

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой нарушается вторичная, третичная и четвертичная структуры белка. Свертывание большинства белков начинается при температуре 50-55 0 С. При кратковременном нагревании денатурация может и не произойти или проявится в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и присутствие электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждение белков при кипячении практически не происходит, так как молекулы белка приобретают положительный или отрицательный заряды соответственно.

Реактивы: водный раствор яичного белка, 1 и 10%-ные растворы уксусной кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор хлорида натрия.

Выполнение работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения, при этом раствор мутнеет, но осадок не выпадает.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают, при этом выпадает хлопьевидный осадок белка.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения, при этом осадок не образуется.

В четвертую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения - белок выпадает в осадок.

В пятую пробирку добавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения, при этом осадок не выпадает.

Объяснить наблюдаемые явления, если известно, что в состав яичного белка входят: яичный альбумин с рН_ИЭТ = 4,8 и яичный глобулин с рН_ИЭТ = 6,6.

Осаждение белков органическими растворителями.

Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) разрушают гидратную оболочку белка, что приводит к понижению его устойчивости и выпадению белка в осадок.

Осаждение белков этанолом обратимо при кратковременном воздействии реагента и без нагревания. Длительный контакт белка со спиртом приводит к необратимой денатурации.

Реактивы: раствор яичного белка, этиловый спирт, ацетон.

Выполнение работы. К 1 мл раствора белка прибавляют 2 мл этилового спирта и взбалтывают. Выпадает осадок белка, который вновь растворяется при разбавлении водой.

К 1 мл того же раствора белка прибавляют 2 мл ацетона и энергично встряхивают. Раствор белка мутнеет.

Осаждение белков минеральными кислотами.

Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом возможно образование комплексных соединений. Все это приводит к необратимой денатурации белка. Осадок белка, полученный под действием кислот, в избытке серной и соляной кислоты растворяется, но не растворяется в избытке азотной кислоты.

Реактивы: раствор яичного белка, концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот.
Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора кислот: в первую – соляной, во вторую - серной, в третью – азотной. Осторожно по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешивались, приливают равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого кольца. Пробирки осторожно встряхивают, добавляют избыток кислот и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках.

Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями свинца, ртути, серебра, меди и других тяжелых металлов. В этом случае денатурация белка вызывается адсорбцией ионов тяжелых металлов на поверхности белковых молекул с образованием нерастворимых комплексов.

Избыток некоторых солей (сульфата меди, ацетата свинца и других) ведет к растворению осадка (пептизации).
Реактивы: раствор яичного белка, 1%-ный раствор сульфата меди, 5%-ный раствор ацетата свинца, 1%-ный раствор нитрата серебра.

Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора яичного белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую – сульфата меди, во вторую – ацетата свинца, в третью – нитрата серебра до выпадения осадков. Затем прибавляют избыток солей и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках. Осадок, образованный нитратом серебра, не растворяется в избытке соли.

Осаждение белков нейтральными солями (высаливание).

Выпадение белков в осадок при действии на них растворов нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов называется высаливанием. Этот процесс основан на дегидратации белков и нейтрализации зарядов белковых частиц адсорбирующимися на них ионами соли. При этом белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются и выпадают в осадок.

Изменяя концентрации солей, можно выделить различные белковые фракции. Так, в случае высаливания хлоридом натрия, глобулины (pH_ИЭТ = 6.6) осаждаются насыщенным раствором соли, а для осаждения альбуминов (pH_ИЭТ = 4.8) необходимо добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты для нейтрализации заряда белка.

Реактивы: раствор яичного белка с хлоридом натрия, кристаллический хлорид натрия (тонко растертый порошок в виде пудры), 1%-ный раствор уксусной кислоты, 1%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди.

Приготовление раствора белка (с добавлением хлористого натрия).

Белки трех куриных яиц отделяют от желтков, растворяют в 7 мл дистиллированной воды и приливают 3 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.

Выполнение работы. В пробирку наливают 3 мл раствора яичного белка и добавляют до получения насыщенного раствора порошок хлорида натрия. Через 5-6 минут в пробирке наблюдается выпадение осадка глобулинов. Альбумины из нейтральных растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются. Содержимое пробирки отфильтровывают через бумажный фильтр.

В фильтрате остаются альбумины, для их осаждения раствор подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Появившийся осадок отфильтровывают, а в фильтрате с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

Контрольные вопросы.

1. Дайте понятие нативного белка.
2. Какие факторы влияют на растворимость белков?
3. Что происходит при обратимом и необратимом осаждении белков?
4. Какими реактивами вызывается необратимое осаждение белков?
5. Какие органические растворители вызывают осаждение белков из растворов и почему?
6. Как влияет изоэлектрическое состояние на осаждение белков при нагревании?
7. Какие факторы вызывают денатурацию белков и почему?
8. Почему при тепловой денатурации яичного белка в сильно кислой или сильно щелочной среде белок не выпадает в осадок даже при нагревании?
9. На чем основано разделение альбуминов и глобулинов?
10. На чем основан метод высаливания белков?
11. Предложите способ осаждения белков: пепсина (рН_ИЭТ=1,1), уреазы (рН_ИЭТ=4,9), каталазы (рН_ИЭТ=6,7).
12. На чем основаны методы извлечения белков?

Почему человек чувствует себя несчастным?: Для начала определим, что такое несчастье. Несчастьем мы будем считать психологическое состояние.

Организация как механизм и форма жизни коллектива: Организация не сможет достичь поставленных целей без соответствующей внутренней.

Как распознать напряжение: Говоря о мышечном напряжении, мы в первую очередь имеем в виду мускулы, прикрепленные к костям .

Реакции осаждения белков

Известно, что белки в растворе сохраняются в природном состоянии за счёт факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию этих молекул белка и выпадению в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от природы используемых реактивов.

Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Для высаливания белков используют соли щелочных и щелочноземельных металлов (наиболее часто в практике используют сульфат натрия и аммония). Эти соли удаляют водную оболочку (вызывают обезвоживание) и снимают заряд. Между величиной водной оболочки белковых молекул и концентрацией солей существует прямая зависимость: чем меньше гидратная оболочка, тем меньше требуется солей. Так, глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой, – при полном насыщении.

Денатурация белка (необратимое осаждение) сводится к разрушению третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы врезультате разрыва водородных связей и потере им биологических или нативных свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении.

Опыт 1. Высаливание белков сульфатом аммония.

Принцип метода. Высаливание – это добавление к раствору белка нейтральных солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄). Механизм высаливания заключается во взаимодействии анионов (SO₄ 2– ) и катионов (Na + , NH₄ + ) с зарядами белка (группы NH₄ + и COO – ). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Все это приводит к «слипанию» молекул и осаждению.

Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 30 капель неразведённого яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. При этом осаждается альбуминовая фракция белков.

Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония и также смешивают (1:1) с яичным белком, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор, пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок – альбумины.

К образовавшимся осадкам (глобулинов и альбуминов) добавляют воду и наблюдают их растворение. Это доказывает, что высаливание – процесс обратимый.

Оформление опыта: полученные результаты опыта записать в тетрадь и сделать вывод.

Опыт 2. Высаливание белков хлоридом натрия и сульфатом магния.

Принцип метода. Для высаливания белков из растворов применяются хлорид натрия, сульфат натрия, ацетат натрия, сульфат магния, ацетат калия, хлорид кальция, нитрат кальция и сульфат аммония. Некоторые из перечисленных солей высаливают белки не только при насыщении ими раствора; определенные белки высаливаются и при достаточно низких концентрациях солей. К таким солям относится сульфат аммония. Условия, при которых происходит осаждение сульфатом аммония, настолько характерны для отдельных белков (за редкими исключениями), что это свойство белков можно сравнить с растворимостью, характеризующей кристаллические вещества.

Белки состоят из аминокислот и поэтому обладают амфотерными свойствами. При растворении белков в воде ион водорода,появляющийся в результате диссоциации карбоксильной группы, присоединяется к аминогруппе. Поэтому белковые молекулы несут как положительные, так и отрицательные заряды. Величина заряда определяется количеством ионогенных групп. При определённом значении рН суммарный электрический заряд молекулы белка становится равным нулю. Такое значение рН называется изоэлектрической точкой (рJ). В изоэлектрической точке растворы белков имеют минимальную устойчивость, поскольку они лишены основного стабилизирующего фактора – заряда и поэтому легко выпадают в осадок. Определить изоэлектрическую точку белка можно, определив рН, при котором раствор белка имеет наибольшее помутнение. У большинства белков изоэлектрическая точка лежит в слабокислой среде.

Осаждение белков NaCl и MgSO4 - Хлорид натрия и сульфат магния в отличие от сульфата аммония осаждают глобулины из насыщенного раствора. В изоэлектрической точке глобулины этими же солями осаждаются при более низкой концентрации.

В 2 пробирки наливают по 5 мл 1% раствора белка, прибавляют при перемешивании до полного насыщения (когда часть кристаллов остается нерастворённой, несмотря на взбалтывание) в одну пробирку тонко измельченного хлорида натрия, в другую – сульфата магния. Через несколько минут в двух пробирках появляется осадок глобулинов. Осадки отфильтровывают и к фильтрату добавляют несколько капель разбавленной уксусной кислоты (СН₃СООН) – в слабокислой среде выпадают альбумины, поскольку рН раствора альбуминов приблизится к изоэлектрической точке.

В водном растворе белков их частицы являются заряженными и сильно гидратированными, что обуславливает устойчивость белковых растворов. Но при высокой концентрации солей, ионы которых тоже сильно гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул и снимается заряд с белковой молекулы адсорбирующимися на ней ионами соли.

В результате этих двух процессов белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются друг с другом, укрупняются и, наконец, выпадает осадок.

Опыт 3. Свертывание белков при нагревании.

Принцип метода. Выпадение белков в осадок при нагревании характерно почти для всех белков (исключение составляет желатина, не свёртывающаяся при нагревании). Особенно легко и более полно происходит осаждение белка в слабокислой среде, вблизи от изоэлектрической точки. В нейтральной и сильнокислой средах осаждение белков идёт значительно хуже, а в щелочной среде вовсе не наблюдается.

В щелочной среде понижается диссоциация белка по радикалам диаминокислот, молекулы его приобретают отрицательный заряд, вследствие чего остаются в растворе даже при нагревании до кипения.

Добавление к раствору белка нейтральных солей (NaCl) облегчает и ускоряет свёртывание белков при кипячении вследствие наступающего дегидратирования белковых частиц.

В 5 пробирок наливают по 2 мл. белка: первую пробирку нагревают, осадок появляется еще до того, как жидкость закипит. Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты (СН₃СООН) и нагревают. Хлопьевидный осадок белка выпадает скорее и полнее, чем в первой пробирке вследствие того, что при подкислении рН раствора приблизится к изоэлектрической точке белка (заряд белка = 0). В третью пробирку добавляют 0,5 мл. 10%-ной уксусной кислоты (СН₃СООН) и нагревают. Осадка не образуется даже при кипении. В четвертую пробирку добавляют 0,5 мл. 10%-ной уксусной кислоты (СН₃СООН) и несколько капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Осадок есть. В пятую пробирку добавляют 0,5 мл. 10% раствора щелочи и нагревают. Осадок не образуется даже при кипячении. Оформление работы.

1. Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.

Спирта, ацетона, эфира и некоторых др. орг. растворителей.

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, он теряет

свойства гидрофильности и становится гидрофобным. Денатурированный белок неспособен к восстановлению своих первоначальных физ-хим и биологических свойств.

Необратимое осаждение вызывается:

Действием концентрированных минеральных и некот. орг. кислот

Ионов тяжелых металлов

Метод высаливания – метод очистки белков, основанный на различиях в их

растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего используют разные концентрации солей сульфата аммония –

(NH₄)₂SO₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

2. Гель-фильтрация – хроматографический метод, основанный на том, что

вещества, отличающиеся по молек. массе, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами.

Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества

(сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы геля с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза – жидкость внутри гранул, в которую способны проникать

низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой.

Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором.

Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы, будут перемещаться

с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля.

На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций.

3. Электрофорез белков – метод основан на том, что при определённом значении

рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Проводят на носителях: бумаге, крахмальном или полиакриламидном геле и т.д.

Электрофорез на бумаге – скорость миграции белка зависит от заряда;

Электрофорез в геле – скорость миграции зависит от заряда и молекулярной массы.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше: т.о. белков сыворотки можно выделить 18 фракций, а на бумаге только 5 основных

(альбумины, α1-, α₂-, β-, γ-глобулины)

Для обнаружения белковых фракций бумагу или гель обрабатывают красителем.

Окрашенный комплекс белков выявляет расположение различных фракций на носителе.

4. Ионообменная хроматография основана на различии знака и величины заряда

белков при определенном значении pН

При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку,

заполненную твердым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нем в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвиж. фазы используют ионообменники – полимерные

орг. вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

«+» заряженные анионообменники (диэтиламиноэтилцеллюлоза, содержащая катионные группы)

«-» заряженные катионообменники (карбоксиметилцеллюлоза, содержащвя анионные группы)

При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с

ионообменником зависит от количества заряженных групп в молекуле.

Белки, адсорбированные на ионообменнике, можно смыть (элюировать)

буферными растворами с различной конц. соли и разными значениями рН. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН меняет заряд белковой молекулы, что приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок

5. Аффинная хроматография – основана на избирательном взаимодействии

белков с лигандами, прикреплёнными к твёрдому носителю.

В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если

выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д.

Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор,

содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом

Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с

изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некот. случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Методы количественного определения белков.

1. Колориметрия – физический метод химического анализа, основанный на

определении концентрации вещества по интенсивности окраски растворов

Биуретовый метод – образование в щелочной среде комплекса пептидных связей с ионами меди. 540нм

Метод Лоури- образование комплекса ароматических АК с реактивом Фолина + биуретовая реакция. 750нм

Метод Брэдфорд- основан на связывании с белками красителя кумасси синего,

спектр поглощения которого при этом меняется. 595нм

2. Спектрофотометрия – физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра.

Спектрофотометрический метод – основан на способности ароматических АК

Высаливание и денатурация белков. Сходство и различие процессов. Значение процессов высаливания и денатурации белков для практической медицины.

Процесс осаждения белков нейтральными солями (высокие концентрации солей щелочных и щелочноземельных металлов) называется высаливанием. Механизм состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков и заряд, являющие факторами устойчивости.

Характерной особенностью белков, полученных высаливанием, является сохранение ими нативных биологических свойств после удаления соли. Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь раствориться после уменьшения концентрации солей путем диализа или разведением водой.

В медицинской практике для высаливания чаще всего применяют сульфат аммония или натрия (высокие концентрации). Альбумины осаждаются при 100% насыщении (NH₄)₂SO₄. Глобулины – в полунасыщенном растворе (NH₄)₂SO₄.

Высаливание широко используется для разделения и очистки белков в научно-исследовательской работе и медицинской практике.

Понятие о денатурации, факторы, вызывающие денатурацию, механизм, обратимость, применение

реакций осаждения белка для его обнаружения в биологических жидкостях.

Разрушение структуры белка и потеря им своих нативных свойств (биологических, физико-химических) называется денатурацией. Осажденный денатурированный белок, в отличие от белка, осажденного путём высаливания, утрачивает свои нативные свойства. Денатурирующие факторы делятся на:

1) физические (температура, радиация, ультрафиолетовое излучение)

2) механические (вибрация и т.д.)

3) химические (концентрированные кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов и т.д.)

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы.

Денатурация используется для определения белка в моче при заболеваниях почек (пиелонефрите), мочевого пузыря (цистите), предстательной железы (простатите), а также при отравлении солями тяжелых металлов.

Метод высаливания используют в клинических лабораториях для разделения альбуминов и глобулинов, определения их соотношения в сыворотке крови.

1. используя процесс денатурации в мягких условиях, его используют для получения и хранения ферментов в низких температурах.

2. в медицине денатурацию используют для осаждения чужеродных белков, при ожогах, обморожениях.

Методы выделения и очистки белков.

1. Избирательная денатурация. Многие белки денатурируются и выпадают в осадок при нагревании раствора до 50-70 °С или при подкислении до рН ≈ 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то часть посторонних белков можно удалить из раствора таким способом.

2. Высаливание представляет собой процесс осаждения белков из раствора при добавлении различных солей. Чаще всего используют зависимость растворимости белков от концентрации сульфата аммония. Если в раствор добавить небольшое количество (NH₄)₂SO₄, (например, 10г на 100мл раствора), то наименее растворимые белки выпадут в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют еще 10 г (NH₄)₂S0₄ и получают второй осадок. Продолжая эту процедуру, получают ряд фракций: в одной из них содержание искомого белка больше, чем в других.

3. Методы ионно-обменной хроматографии и электрофореза основаны на различиях в количестве и природе ионогенных групп аминокислотных радикалов. Для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров.

Электрофорез применяют в различных вариантах. Наиболее простой из них - электрофорез на бумаге. Полоску фильтровальной бумаги пропитывают буферным раствором и включают ее в электрическую цепь с постоянным током. Процедуру проводят в герметически закрытой камере. Белки из электрофореграмме обнаруживают, обрабатывая полоску красителем, связывающимся с белками и образующим цветные соединения. После окончательного разделения белков на фракции, в зависимости от заряда белковой молекулы, отдельные белки вымывают (предварительно разрезав полоску на части) подходящим растворителем и осаждают. Для получения больших количеств очищенного белка вместо полоски бумаги в этом методе используют толстый блок какого-либо инертного материала - крахмала, целлюлозного порошка или полимеры, образующие гели - агар, полиакриламид.

4. Методы гель-фильтрации и ультрацентрифугирования основаны на различиях белков по молекулярной массе.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH₄)₂SO₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул .

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой . После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательнозаряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание)

Соли аммония, щелочных и щелочноземельных металлов — Na₂S0₄, (NH₄)₂ S0₄, NaCl, MgS0₄ и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Этот способ осаждения белков называют высаливанием. Высаливание — обратимый процесс. Осадки можно снова растворить в воде. Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, выделения их в кристаллическом виде.

Реактивы: а) раствор яичного белка с хлоридом натрия; б) хлорид натрия, в виде пудры; в) сульфат аммония, кристаллический, тонко растертый порошок; г) сульфат аммония, насыщенный раствор; д) сульфат магния, кристаллический, тонко растертый порошок; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор: ж) гидроксид натрия, 10%-ный раствор; з) сульфат меди, 1%-ный раствор.

Осаждение сульфатом аммония. В пробирку наливают 2—3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сульфата аммония, последняя порция соли уже не растворяется. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

При полном осаждении белков в фильтрате биуретовая реакция должна быть отрицательной.

Осаждение сульфатом магния или хлоридом натрием. В 2 пробирки наливают по 2—3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую — сернокислого магния. Через 5—6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков (глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах — альбумины. Фильтраты подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты — появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, в фильтрате биуретовая реакция должна быть отрицательной.

Осаждение белков путем высаливания применяется в промышленности.

Осаждение белков органическими растворителями. Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) вызывают дегидратацию белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, что понижает устойчивость белков в растворе (растворимость) и ведет к выпадению в осадок. Лучше всего происходит осаждение белков из нейтрального или слабокислого раствора, в щелочных растворах осаждение органическими растворителями затормаживается. Способствует осаждению также присутствие электролитов (например, хлорида натрия) в растворе.

Осаждение белков спиртом обратимо при условии отсутствия нагревания и кратковременном воздействие реагента.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) этиловый спирт (или ацетон); в) хлористый натрий, кристаллический.

В пробирку наливают 1—2 мл раствора яичного белка, добавляют немного порошка хлорида натрия и взбалтывают до растворения. По каплям приливают 4—6 мл этилового спирта, сильно взбалтывают. Через 5—8 мин. выпадает осадок белка.

Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки с осадком в другую, добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды. Концентрация спирта падает, а белок снова переходит в раствор.

Тепловая денатурация белков.

Свертывание большинства белков начинается уже при температуре 50—55°С. Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул. Нагревание вызывает разрыв дисульфидных связей между полипептидными цепями, что приводит к их раскручиванию и изменению конформации макромолекул. При кратковременном нагревании (при относительно невысоких температурах) денатурация может и не произойти или проявиться в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры (а особенно при кипячении) ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды.

Прибавление электролитов (например, хлорида натрия) ускоряет процесс коагуляции даже в кислой среде.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлорида натрия); б) раствор растительных белков; в) уксусная кислота, 1%-ный раствор; г) уксусная кислота, 10%-ный раствор; д) гидроксид натрия, 10%-ный раствор; е) хлорид натрия, насыщенный раствор.

В пять пробирок наливают по 1—2 мл раствора яичного или растительного белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения: раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг белковых частиц), но осадок не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные заряды, что препятствует их коагуляции.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1 % -ного раствора уксусной кислоты и нагревают: осадок белка выпадает быстро, поскольку заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5—• 8 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения: осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели положительные заряды, что является стабилизирующим фактором и препятствует коагуляции.

В четвертую пробирку добавляют 5—8 капель 10%-ного раствора едкого натра и нагревают до кипения: осадок не выпадает, поскольку мицеллы заряжены отрицательно.

В пятую пробирку прибавляют 4—5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 5—6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения — белок выпадает в осадок.

Читайте также: