Колонии с металлическим блеском

Обновлено: 17.05.2024

На среде Эндо кишечная палочка образует круглые, выпуклые, гладкие колонии ма­линово-красного цвета с металлическим блеском. Среда Эндо — это дифференциально-диагностическая среда, которая кроме питательной основы, среда содержит 1% лактозу и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Свежеприготовленная среда Эндо бесцветна или слегка розовая. При росте на этой среде кишечная палочка разлагает лактозу, образуются кислые продукты, они восстанавливают фуксин из бесцветного соединения в красный и поэтому вырастают колонии, окрашенные в малиново-красный цвет.

3. Изучить развёрнутую реакцию агглютинации с "живой" и "гретой" культурой при идентификации возбудителя колиэнтеритов.

Метод диагностики: бактериологический

Ингредиенты реакции: бактериальная суспензия (взвесь бактерий в физиологическом растворе), диагностические сыворотки, содержащие антитела к О55 и К11 антигенам, физиологический раствор.

Постановка: Диагностические сыворотки разводят в двух рядах, используя физиологический раствор. Для приготовления бактериальной суспензии добавить культуру с поверхности питательной среды в 3-5 мл физиологического раствора, разлить взвесь в 2 стерильные пробирки. Одну из них прогреть на водяной бане при 100°С в течение часа. В первый ряд добавляем несколько капель «живой» бактериальной суспензии, во второй ряд добавляем несколько капель бактериальной суспензии, «гретой» на водяной бане. Инкубируем в термостате 24 часа и учитываем результат.

Учет реакций агглютинации: Положительный результат — образование белого зонтика, отрицательный образование белой пуговки. Реакция считается положительной, если агглютинация с гретой культурой отмечается в разведении сыворотки не ниже половины тит­ра сыворотки, а с живой не менее, чем 1:200 (диагностический титр реакции). Если реакция положительна, то выдают ответ в следующей формулировке "Выделена патоген­ная кишечная палочка серовара О55:К11.

Учесть биохимические свойства E. coli.

Ингредиенты: Среда Ресселя, которая содержит лактозу и глюкозу и пестрый ряд Гиса, состоящий из пяти углеводов. Кроме питательной основы и углевода к среде добавлен индикатор. Исходный цвет среды розовый, при образовании кислоты цвет среды становится синим. Газообразование улавливают с помощью поплавков-коротких стеклянных трубочек, запаянных с одного конца, помещенных в питательную среду, открытым концом вниз. Образование индола и сероводорода определено с помощью индикаторных бумажек. При образовании индола индикаторная бумажка, пропитанная насы­щенным раствором щавелевой кислоты, розовеет. При образования сероводорода индикаторная бумажка, пропитанная уксуснокислым свинцом, чернеет.

Постановка: Пересев колоний со среды Ресселя на ряд Гиса и МПБ и инкубация 24 часа в термостате.

Биохимические изменения на пестром ряду с посевом кишечной палочки

Лактоза Глюкоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ
Индол Сероводород
До кислоты и газа До кислоты и газа До кислоты и газа До кислоты и газа - + -

Таким образом, для кишечной палочки ха­рактерна ферментация лактозы, глюкозы, мальтозы и маннита с обра­зованием кислоты и газа, отсутствие ферментации сахарозы и образо­вание индола.

Заполнить таблицу «Заболевания, вызываемые диареегенными E. сoli».

Решение ситуационных задач

III модуль «Кишечные инфекции»

Занятие № 2

ТЕМА: Микробиологическая диагностика дизентерии, брюшного тифа, паратифов А и В, сальмонеллезных гастроэнтеритов

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать таксономию, основные свойства возбудителей, эпидемиологию, микробиологическую диагностику, принципы профилактики и лечения

уметь:учитывать характер роста на средах Эндо, Левина возбудителей дизентерии, ставить реакцию агглютинации на стекле, делать пересев на среду Ресселя, учитывать их биохимические свойства и реакцию агглютинации с парными сыворотками, реакцию Видаля

Задание на дом

1. Вопросы для самоподготовки:

1) Характеристика биологических свойств и особенности микробиологической диагностики дизентерии.

2) Характеристика биологических свойств и особенности микробиологической диагностики брюшного тифа, паратифов А и В.

3) Характеристика биологических свойств и особенности микробиологической диагностики сальмонеллёзных гастроэнтеритов.

Методы изучения ферментативной активности бактерий

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков - образование щелочей, H2S, NH3.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.

Таблица 4. Характеристика колоний энтеробактерий различных родов

небольшие (1-1,5 мм в диаметре), бесцветные, слегка выпуклые, с ровным краем и блестящей поверхностью, прозрачные. S. dysenteriae 1 формируют более мелкие и нежные колонии, а на среде Плоскирева растут скудно

На СПА S. sonnei нередко образуют колонии I и II фаз

S. sonnei образуют иногда, кроме описанных (I фаза), и колонии более крупные, плоские, с неровным краем, напоминающие виноградный лист (II фаза)

размер чаще 2-2,5 мм в диаметре, иногда и 1 мм, слегка выпуклые, с ровным краем и гладкой поверхностью, влажные

более крупные, чем колонии шигелл и сальмонелл, многообразие по окраске, плотности и форме; могут быть выпуклые или плоские, с ровным или слегка волнистым краем, непрозрачные или полупрозрачные и слегка опалесцирующие, влажные или сухие, иногда слизистые, напоминающие колонии клебсиелл, а также более нежные и прозрачные, похожие на колонии шигелл и сальмонелл; у лактозоположительных штаммов на среде Эндо - темно-красные с металлическим блеском или без него, розовые или с бесцветным ободком и интенсивно красным или розовым центром, а на среде ЭМС - темно-синие с металлическим блеском или розовые; у лактозоотрицательных штаммов - под цвет среды или с розоватым оттенком (на Эндо и ЭМС), а на среде Плоскирева - с желтоватым оттенком

более крупные, чем колонии шигелл и сальмонелл, выпуклые; у лактозоотрицательных штаммов - слегка опалесцирующие, в тон среды или с розоватым оттенком; у лактозоположительных - интенсивно розовые или красные с темным центром, но не дающие характерного для эшерихий металлического блеска; рост колоний сопровождается резким неприятным запахом

большие (диаметр 3 мм), выпуклые, влажные, слизистые, нередко сливающиеся друг с другом или менее крупные, неслизистые, сухие; колонии лактозоположительных штаммов сходны с колониями эшерихий, с металлическим блеском или без него; колонии могут быть красные, розовые, белые, прозрачные, бесцветные, с белым ободком в сочетании с темным или розоватым центром, а на среде Плоскирева могут быть бежевые или желтые

В течение первых суток роста (при 22°C) колонии мелкие (росинки), обычно выпуклые, блестящие, бесцветные, с ровным краем; в течение вторых суток становятся крупнее, при этом колонии Y. enterocolitica (на ЭМС) фиолетовые с металлическим блеском, могут приобретать розовый оттенок, а Y. pseudotuberculosis остаются неокрашенными

по размеру, форме и окраске сходные с колониями эшерихий и клебсиелл

полупрозрачные, бесцветные или имеющие оттенок среды, розоватые, сероватые; на среде Плоскирева дают скудный рост и нередко напоминают колонии шигелл

бесцветные, по размеру и форме трудно отличимые от колоний шигелл или сальмонелл

P. vulgaris, P. mirabilis, проявляя способность роения, дают сливной рост, другие виды образуют колонии, сходные с колониями сальмонелл или шигелл, колонии P. inconstans весьма сходные с колониями шигелл

бесцветные или слегка розоватые (на Эндо), полупрозрачные, сходные с колониями сальмонелл или шигелл

При 37°C не растут или дают замедленный скудный рост; при 25-27°C (оптимальной температуре культивирования) колонии с разнообразными характеристиками, более всего сходные с колониями эшерихий

Для получения количественных показателей обсеменения исследуемого материала УПЭ, в случаях их выявления, в отсутствие патогенных энтеробактерий и решения вопроса об этиологической значимости могут быть проведены дозированные посевы из проб материала на пластинчатые среды.

Для жидких субстратов (клинический материал) разведения готовят объемным методом, разводя 0,1-1,0 мл исследуемой пробы в соотношении 1:10 (разведение и бактерий рода Citrobacter.

Отобранные для дальнейшего изучения колонии пересевают в одну из сред для первичной идентификации. При целенаправленном исследовании на ЭПЭ первичный отбор колоний (не менее 2-3 каждой разновидности) проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (к большому числу наиболее распространенных сероваров ЭПЭ). Остаток колонии, давшей агглютинацию с указанной сывороткой, отсевают в среду для первичной идентификации и на скошенный агар (для дальнейшего серологического изучения).

Агар Эндо/Агар Эндо, модифицированный/Основа агара Эндо/Основа модифицированного агара Эндо/Агар Эндо, модифицированный

m029 - Endo Agar/ Агар Эндо

m029R - Endo Agar Special/ Агар Эндо, модифицированный

m1077 - Endo Agar Base/ Основа агара Эндо

m1077R - Modified Endo Agar Base/ Основа модифицированного агара Эндо

m1075 - Endo Agar Modified/ Агар Эндо, модифицированный


Endo Agar (M029)
Рост Escherichia coli (красные колонии с металлическим блеском)

Применение: для подтверждения презумптивного теста на колиформы из клинических и неклинических образцов.

Состав**:

Ингредиенты

М029

г/литр

M029R

М1077

M1077R

М1075

Конечное значение рН (при 25ºС)

** Состав выверен и доведен до соответствия необходимым параметрам

Приготовление:

суспендируйте 38,0 г порошка М029 или 40,0 г порошка М029R, или 41,5 г порошка М1077, или 38,0г порошка M1077R, или 38,6 г порошка М1075 в 1000 мл дистиллированной воды. К среде М1077/М1077R добавьте 4 мл 10%-ного раствора основного фуксина (FD059). Нагрейте до кипения для растворения компонентов среды полностью. Стерилизуйте в автоклаве при 1,1 атм. (121ºС) в течение 15 мин. Тщательно перемешайте и разлейте в стерильные чашки Петри. Если затвердевшая культуральная среда слишком красная, то для обесцвечивания добавьте несколько капель (макс. 1 мл / л) свежеприготовленного 10% -ного раствора сульфита натрия и прокипятите.

Предупреждение: основной фуксин – сильный канцероген, поэтому следует избегать аспирациии порошка и попадания его на кожу.

Принципы и интерпретация:

Агар Endo был разработан компанией Endo для дифференциации грамотрицательных бактерий на основе ферментации лактозы с одновременным ингибированием грамположительной микрофлоры (2) сульфитом натрия и основным фуксином без использования желчных солей, как это традиционно применялось. Агар Эндо, также известный как фуксин сульфит и инфузионный агар, был использован для выделения возбудителя брюшного тифа. С течением времени появилось много модификации этой среды. Агар Эндо рекомендован APHA в качестве важного средства при микробиологическом исследовании воды и стоков, молочных продуктов и продуктов питания (1,5,6). Агар Эндо используется для подтверждения обнаружения и подсчета презумптивной Escherichia coli после проверки питьевой воды. Он также используется для обнаружения и выделения Escherichia coli из продуктов питания, молока и молочных продуктов.

Среда содержит пептон, который обеспечивает азот, углерод, витамины и минералы, необходимые для роста бактерий. Сульфит натрия и основной фуксин делают среду селективной, подавляя грамположительные микроорганизмы. Колиформы образуют розовые колонии вследствие ферментации лактозы, тогда как лактозонеферментирующие микроорганизмы образуют неокрашенные колонии. Лактоза ферментируется до альдегида и кислоты. Альдегид, в свою очередь, освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У колоний Escherichia coli эта реакция очень выражена, сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний. Среду следует хранить вдали от света, чтобы избежать фотоокисления.

Тип образца:

Клинические образцы - моча; образцы продуктов питания и молочных продуктов; образцы воды

Меры предосторожности:

Только для диагностики In vitro! Перед вскрытием контейнера прочитайте этикетку. При работе с клиническими образцами должны соблюдаться уставленные правила безопасности. Используйте защитную одежду / защитные перчатки / защиту лица/ защиту глаз.

Ограничения:

  1. Помимо Enterobacteriaceae, могут также расти другие грамотрицательные бактерии и дрожжи.
  2. Избегайте воздействия света на среду, так как это может привести к фотоокислению и снижению производительности среды.
  3. Следует избегать перегрева среды, так как это может ухудшить её производительность.
  4. Для дальнейшего подтверждения результатов должны быть проведены дальнейшие биохимические испытания

Контроль качества

Внешний вид:

Светло-лилового цвета гомогенный сыпучий порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному (М029), 0,96% (M029R), 1,20% (M1077) 1,0%-ному (М1077R) или 1,25%-ному (М1075) агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

В чашках Петри гель оранжевато-розового цвета, прозрачный, с легкой опалесценцией и незначительным преципитатом.

Реакция:

При 25ºС водные растворы М029 (3,80% в/о), М029R (4,0% в/о), М1077 (4,15 % в/о), M1077R (3,60% в/о) имеют рН 7,5 ± 0,2, водный раствор М1075 (3,86% в/о) имеет рН 7,4 ± 0,2.

М-Агар Эндо

Эту среду используют для подсчета колиформных бактерий в воде двухэтапным мембранным методом.


Метод мембранных фильтров.
Рост на среде M-Endo Agar LES (M1106)
Escherichia coli

Состав**:

Приготовление:

Размешать 51,0 г порошка в 980 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. НЕ АВТОКЛАВИРОВАТЬ СРЕДУ. Остудить до 45°С и асептично добавить 20 мл 95%-ного этанола. Перемешать и разлить по 4 мл в чашки Петри диаметром 60 мм. При использовании больших чашек наливать такое количестве среды, чтобы образовался слой толщиной 1,5 мм. НЕ ДЕРЖАТЬ ЧАШКИ СО СРЕДОЙ НА СВЕТУ.

Предупреждение: основной фуксин является потенциальным канцерогеном, поэтому при обращении с ним следует избегать вдыхания порошка и попадания его на кожу.

Принцип и оценка результата:

Эта среда дана в прописи McCarthy, Delaney и Grasso (1) и используется для подсчета колиформных бактерий в воде (2).Метод мембранных фильтров для подсчета колиформных бактерий более достоверен и ценен, по сравнению с методом бродильных проб. Указанные выше авторы предложили использовать двухэтапный метод обогащения для уменьшения токсического воздействия окружающей среды на колиформные бактерии и повышения их выживания. Пропись данной среды основана на прописи Эндо, предложенной для дифференциации бактерий по способности ферментировать лактозу (3).

Гидролизат казеина, триптоза, пептический перевар животной ткани и дрожжевой экстракт служат источником необходимых питательных веществ (особенно, азотистых) для роста колиформных бактерий. Лактоза является ферментируемым субстратом. Натрия дезоксихолат, сульфит натрия и основной фуксин подавляют рост грамположительных микроорганизмов. Фосфаты придают среде буферные свойства. Колиформные бактерии ферментируют лактозу, формируют красные колонии и окрашивают в тот же цвет среду вокруг них. Микроорганизмы, не ферментирующие лактозу, образуют бесцветные колонии.

На первом этапе обогащения подложку смачивают Лаурил-триптозным бульоном ( М080 ). Мембранный фильтр, через который пропущена исследуемая вода, асептично накладывают на подложку и без переворачивания инкубируют 2 ч при 35°С во влажной камере. Затем фильтр асептично переносят на М-Агар Эндо в чашке и инкубируют при той же температуре в течение 24 ч. В другом варианте подложку для мембранного фильтра помещают на внутреннюю поверхность крышки чашки с М-Агаром Эндо, смачивают 2 мл Лаурил-трпитозного бульона ( М080 ) и инкубируют 1-1,5 ч при 35°С. На втором этапе подготовленный фильтр перекладывают прямо на поверхность агара и инкубируют, как описано выше. Через 24 инкубирования предположительно колиформные бактерии формируют золотисто-зеленые колонии с металлическим блеском.

Определение концентрации колиформных бактерий: отмечают общее количество колиформных бактерий на 100 мл исследуемой воды. При обнаружении на фильтре 20-80 колоний (но не более 200) можно экстраполировать результат исследования по следующей формуле.

Количество колиформных в 100 мл = кол-во колоний колиформ х 100 : кол-во профильтрованной воды.

Контроль качества:

Внешний вид порошка:

Гомогенный сыпучий розовый порошок.

Плотность готовой среды:

Образуется среда, соответствующая по плотности 1,5%-ному агаровому гелю.

Цвет и прозрачность готовой среды:

Среда имеет красную окраску, слегка опалесцирует, если в чашках Петри формируется гель.

Кислотность среды:

При 25°С водный раствор (5,1% вес/об с 2% об/об этанола) имеет рН 7,2 ± 0,2.

Читайте также: